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História Mundial dos Ensaios Hormonais

Por José Gilberto Henriques Vieira

Professor Afiliado, Disciplina de Endocrinologia, EPM/UNIFESP; Assessor Médico, Grupo Fleury, São Paulo

Introdução

A evolução da Endocrinologia ao longo do último século e início do atual ocorreu paralelamente ao desenvolvimento e validação das dosagens hormonais. Na medida em que pesquisas básicas evidenciavam a possibilidade do controle hormonal de um processo fisiológico ou da implicação de algum potencial hormônio numa patologia, a tentativa de medida destes agentes foi um processo contínuo. Ensaios mais confiáveis, específicos e sensíveis levaram a diagnósticos mais precoces e à evolução concomitante do conhecimento dos sistemas endócrinos e, consequentemente, do diagnóstico mais precoce e da melhoria das intervenções terapêuticas. Uma história fascinante, similar à de muitas áreas do conhecimento médico, mas que na área da Endocrinologia foi particularmente marcante.

A compilação sistemática do conhecimento através de publicações acessíveis é hoje uma realidade prática, mas esta realidade só evoluiu e sistematizou-se na segunda metade do século passado. No caso específico da Endocrinologia o conhecimento acumulado na primeira metade do século passado era muito disperso e limitado. A especialidade nascente era exótica e baseada principalmente na descrição de casos  clínicos e afora o Diabetes, todas as outras patologias estudadas eram caracterizadas por apresentações extremas: gigantes, anões, intersexuados, etc. Os ensaios disponíveis, que tentavam mensurar os hormônios que influenciavam essas condições clínicas de excesso ou deficiência, eram disponíveis em poucos centros de estudo e baseavam-se principalmente em bioensaios.

Bioensaios

Talvez a visão mais popular do conceito de bioensaio seja o teste de Galli-Mainini, publicado em 1947 como teste de gravidez. O teste, desenvolvido e validado na Argentina, consistia na injeção subcutânea de urina de mulheres com suspeita de gravidez em sapos machos. Após 3 horas uma amostra de urina era retirada da cloaca e a presença de espermatozoides nesse material indicava o estímulo gonadal por uma gonadotrofina. O teste foi utilizado em rotina ao longo de pelo menos 30 anos e sua substituição por testes imunológicos só foi possível após o considerável desenvolvimento no conhecimento sobre a estrutura do hormônio em estudo, no caso a gonadotrofina coriônica. Evidentemente alternativas, dentro do mesmo conceito (estímulo gonadal), utilizando animais como ratos e camundongos, foram desenvolvidos visando padronização e obtenção mais regular de animais para os testes. Os sapos que cheguei a utilizar pessoalmente no início dos anos 70 eram capturados na várzea do rio Pinheiros, e seguramente a oferta aumentava no verão. Além disto, a criação de sapos em laboratório nunca foi um processo padronizado e viável.

Inúmeros outros bioensaios foram desenvolvidos e utilizados em rotina diagnóstica nos anos 30 a 60 do século passado. Sua utilização em diagnóstico ou pesquisa só foi abandonada de fato nos anos 80. A utilização de bioensaios implicava em alguns pré requisitos práticos e conceituais. A existência de um biotério bem estruturado e intrinsecamente complexo para garantir a disponibilidade de animais “padrão” (camundongos, ratos, coelhos, etc) era fundamental. Pessoal experiente e com vivência na observação de fenômenos como hiperemia ovariana em ratas ou crescimento diafisário em tíbia de camundongos, era fundamental, e seu treinamento um dos maiores desafios.

Métodos Preparativos e Padrões de Referência

Uma das maiores limitações dos bioensaios era sua sensibilidade analítica e sua especificidade muito genérica. Para detectar, por exemplo, hiperemia de ovários em ratas após injeção de urina, eram necessárias as quantidades totais existentes em urina de 24h de uma mulher menopausada. No caso específico de pesquisa de gonadotrofinas hipofisárias, métodos de concentração eram usados como, por exemplo, a adsorção em caolin ou em membranas de colódio que possibilitavam a redução do material a um volume de injeção compatível. A necessidade de métodos preparativos pré-análise era quase universal nos bioensaios. Só não era necessário quando as quantidades do hormônio eram excepcionalmente elevadas, como no caso da gonadotrofina coriônica na gravidez. Lembrar que o teste de Galli-Mainini tornava-se positivo com atrasos menstruais de 10 a 15 dias, o que sabemos hoje em dia corresponder a uma condição em que os níveis de hCG encontram-se acima de 10.000 UI/L. Ou seja, se tentássemos utilizar o teste em amostras de mulheres menopausadas, um processo de extração/concentração, como os descritos acima, deveria ser empregado, tendo-se sempre em mente a possibilidade do processo preparativo introduzir algum elemento tóxico letal para o animal de experimentação.

Foi nesta época, e tendo como base preparações impuras, é que foram descritas as primeiras tentativas de uniformizar, e portanto, tornar comparáveis, os resultados dos bioensaios. Unidades em uso até hoje, como as UI de insulina, foram descritas com base na resposta de bioensaios a preparações padronizadas. Este processo é aceito até hoje para alguns hormônios, em especial os de estrutura mais complexa, que em geral resulta em heterogeneidade de formas circulantes, como as gonadotrofinas e o TSH, mesmo tendo-se acesso a formas recombinantes extremamente puras o que possibilitaria o uso de unidades de massa, como ocorre atualmente no caso de GH e prolactina. 

A descrição, purificação e síntese dos hormônios esteroides, nos anos 40 e 50, abriu uma nova fronteira na área de dosagens hormonais. Na realidade eram estruturas químicas relativamente simples, que podiam ser sintetizadas e cuja ação biológica podia ser bem definida. O conhecimento detalhado de suas estruturas e características bioquímicas propiciou o desenvolvimento de reações específicas para determinados grupamentos existentes em vários esteroides.

Ensaios Bioquímicos

Iniciou-se então uma nova era de dosagens hormonais, baseadas em ensaios bioquímicos e dos quais os maiores exemplos foram as dosagens urinárias de 17 hidroxi e ceto esteroides (17OH e 17KS). Foram durantes décadas a base para a definição de um série de condições clínicas, em especial relacionadas à função adrenal. Assim com as reações de Zimmermman (17OH) ou de Porter-Silver (17OH), outras foram devenvolvidas de maneira a medir com razoável precisão os estrógenos urinários (fenol esteroides) e os progestágenos (preganediol).

Outro exemplo marcante desta época de desenvolvimento de testes bioquímicos foi o desenvolvimento do método do PBI, ou protein-bound iodine, baseado na incineração da amostra de soro e posterior medida colorimétrica do iodo total existente. Estes métodos, incluindo outros como a dosagem fluorométrica do cortisol sérico, constituiram a base laboratorial para o desenvolvimento da Endocrinologia nos anos 50, 60 e início dos anos 70. As limitações principais se referiam a sensibilidade, especificidade e em muitos casos, necessidade de urina de 24 horas, com todos seus problemas técnicos e funcionais, em especial num ambiente ambulatorial. Métodos mais específicos demandavam processos preparativos complexos e trabalhosos como cromatografia em papel. Quando fui introduzido ao Laboratório de Hormônios da Disciplina de Endocrinologia da EPM/UNIFESP, em 1970, as rotinas laboratoriais disponíveis eram: PBI sérico, dosagens de 17OH e 17KS urinários, prenanediol urinário, fenoesteróides urinários, VMA na urina e pesquisa de gonadotrofinas urinárias por bioensaio (camundongos) em urina de 24 horas.

Imunoensaios

A viabilização do uso rotineiro das dosagens hormonais, tanto em relação à sensibilidade, como especificidade e principalmente disponibilidade, tornou-se realidade após a descrição dos imunoensaios. O trabalho seminal de Solomon Berson e Rosalyn Yalow de 1959 foi tão importante que rendeu aos dois o prêmio Nobel de Medicina em 1977. O primeiro ensaio deste tipo descrito foi um radioimunoensaio para insulina plasmática. Em resumo o ensaio baseava-se na competição entre uma quantidade fixa e limitada de insulina marcada (inicialmente com Iodo 131 e posteriormente com Iodo 125) e a insulina existe numa amostra, ou no padrão, por ligação em uma quantidade limitada de anticorpo anti-insulina. Após a separação entre a insulina ligada ao anticorpo daquela que não ligada, a fração ligada (ou livre, ou ambas) era quantificada em um contador gama e uma curva padrão construída. A partir desta curva padrão, a contagem obtida nas amostras permitia extrapolar a quantidade de insulina existente. Este princípio está esquematizado na primeira parte da Figura 1 (A). Dos anos 70 aos 80 esta metodologia teve ampla difusão e foi a base para o desenvolvimento da Endocrinologia moderna. Para todos os hormônios conhecidos e que foram descritos, purificados e sintetizados, um radioimunoensaio foi descrito.

Esta evolução incluiu os hormônios esteroides e as tironinas, a principio consideradas não imunogênicas e portanto incapazes de induzir a produção de anticorpos. O problema foi contornado pelo acoplamento destas estruturas a macromoléculas, como albumina, onde elas passariam s se comportar como haptenos. Este princípio está representado na Figura 2, incluindo a técnica de imunização que empregamos nos anos 70 e 80 para a produção de uma série de anticorpos.

Como a evolução metodológica é praticamente contínua, um trabalho publicado por Georges Koehler e Cesar Milstein em 1975 (que resultou também em prêmio Nobel de Medicina em 1984) descrevendo a produção de anticorpos monoclonais, ensejou uma revolução na área dos imunoensaios. Já em 1968, dois pesquisadores ingleses (Miles e Hales) haviam descrito o conceito de ensaio imunométrico, não competitivo, que representamos na parte B da Figura 1. Este conceito apresentava uma série de vantagens teóricas sobre os radioimunoensaios competitivos pois baseia-se em excesso de anticorpos, tanto de captura como de revelação, o que além de permitir dupla identificação torna o equilíbrio da reação mais rápida. O potencial de maior sensibilidade e de maior alcance da curva padrão era evidente. O único problema era a purificação dos anticorpos policlonais então disponíveis para uso em ensaios deste tipo. A descrição da produção de monoclonais veio a contornar este problema, e com sua padronização durante a década de 80, toda uma série de novos ensaios foram descritos. Na figura 3 está representada uma colônia de células produtoras de anticorpos monoclonais que desenvolvemos no final dos anos 80 e sua purificação após produção de ascite em camundongos. O ensaio de TSH pode ser utilizado como exemplo deste tipo de evolução metodológica, os radioimunoensaios desenvolvidos no início dos anos 70 que apresentavam limitações quanto à sensibilidade (em torno de 1,0 mUI/L) e tempo de execução (dias), foram substituídos por ensaios imunométricos de alta sensibilidade e tempo de execução curto. A substituição dos marcadores radioativos por marcadores fluorescentes e quiminoluminescentes, com maior capacidade de geração de sinal, associado ao desenvolvimento de equipamentos automáticos, trouxe a maioria das dosagens hormonais para a rotina diagnóstica que dispomos neste início do século 21.

No entanto uma classe de hormônios não se beneficiou destes avanços, especificamente aqueles de baixo peso molecular como os esteroides e tironinas, pois sua pequena estrutura não permite o acoplamento simultâneo de dois anticorpos. O mesmo desenho competitivo continuou (e continua) sendo utilizado. Evidentes progressos em termos de uso de traçadores não radioativos e sistemas automatizados foram introduzidos, mas os problemas básicos continuaram presentes.

Espectrometria de Massas

Os princípios da espectrometria de massa foram desenvolvidos no início do século passado. O deslocamento de partículas carregadas (relação massa/carga, m/z) submetidas a um campo elétrico em condições de vácuo propicia sua diferenciação constitui a base simplificada da espectrometria de massas. De início, apenas partículas voláteis (gases) poderiam ser submetidas ao processo, mas o desenvolvimento, em especial a partir dos anos 70, de novos sistemas de ionização e injeção (APCI, APPI, etc), aproximaram a metodologia da rotina diagnóstica. O primeiro grupo de hormônios a se beneficiar desta metodologia foram exatamente os esteroides, que haviam sido “deixados de lado” na evolução dos imunoensaios (como visto acima). O acoplamento de sistemas de purificação por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) com espectrômetros em tandem (HPLC-MS/MS) permitiu o desenvolvimento de equipamentos e metodologias de alta sensibilidade e especificidade.  São consideradas neste início de século 21 as metodologias de referência para a dosagem de esteroides tanto urinários como séricos. Uma vantagem adicional deste tipo de metodologia é a possibilidade de em uma única amostra (“corrida”) serem analizados vários esteróides de um mesmo grupo. A complexidade técnica os custos dos equipamentos ainda são fatores limitantes, de maneira que sua aplicação ainda está limitada a poucos laboratórios de referência. Outro grupo de hormônios que deverá ser beneficiado pela introdução dos sistemas de HPLC-MS/MS são as tironinas.

Perspectivas

Numa visão centrada em 2013 podemos projetar os imunoensaios, em especial não competitivos, como metodologia dominante nas dosagens hormonais. A exceção  serão os esteroides e tironinas, onde a introdução das metodologias baseadas em HPLC-MS/MS estão levando a uma revolução técnica que deverá ser completada na próxima década.

Referências e Sugestões de Leitura Complementar

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